Name: RPA 恒温扩增试剂盒
Brand: EZassay

Question 1

Q1：如何设计RPA/RAA的引物？

Accepted Answer

首先最佳引物或者gRNA需要通过实验筛选得到。目前软件无法准确预测。请知悉。
对于初学者，可以利用在线软件辅助设计。在输出结果中，优先选择排序靠前的引物。建议正向引物选3~5条，反向引物选3 ~5条，然后进行实验对比，挑选最佳组合。

Question 2

Q2：PCR引物能否用于RPA/RAA扩增？

Accepted Answer

可以。但效果不是最佳，使用PCR引物的话大概率会降低恒温扩增的效率和灵敏度。恒温扩增的引物一般在30-35bp。引物对于RPA/RAA的特异性与灵敏度非常重要，建议通过软件设计，然后进行实验筛选，得到最佳引物对。

Question 3

Q3：可以使用PCR探针吗？

Accepted Answer

不行。

Question 4

Q4：RPA/RAA目的序列的扩增长度一般是多少？

Accepted Answer

一般来说，我们建议由两个恒温扩增引物产生的扩增子通常不应超过约 500 bp。 恒温扩增产物的大小可能没有下限，但 恒温扩增引物的最小大小要求扩增子通常长于 80bp。理想的扩增子应为 100-200 个碱基对。

Question 5

Q5：建议的反应温度是多少？

Accepted Answer

可以在37~42℃范围内进行反应，更高的温度会损害酶的活性，更低的温度本身是可以进行反应的，但是更低的温度会导致酶活性降低。对于RT试剂盒，我们建议在40°C下进行反应，因为逆转录酶在稍高的温度下表现更好。

Question 6

Q6：恒温扩增试剂盒如何选择？

Accepted Answer

待测样本（template）是DNA，选择DNA检测试剂盒。
待测样本（template）是RNA，选择RNA检测试剂盒。
如果RNA已经逆转录成cDNA，则用DNA试剂盒。
恒温扩增试剂盒分为基础型，荧光型和试纸型。
基础型：无探针。仅完成扩增。跑DNA胶观察结果。或与CRISPR技术联用。
荧光型：含有ExoIII (外切酶III)，需要加入Exo探针，读荧光信号。
试纸型：含有Nfo (内切酶IV)，需要加入Nfo探针，试纸条观察结果。

Question 7

Q7：RPA/RAA 基础型（Basic），荧光型（Exo）和试纸型（Nfo）什么区别？

Accepted Answer

-基础型，类似PCR，只是完成DNA扩增，用DNA胶观察结果或与CRISPR技术结合使用。
-荧光型（Exo），在基础型的基础上，引入荧光探针（Exo probe），类似荧光探针PCR。可以用荧光仪读荧光值。
-试纸型（Nfo），在基础型的基础上，引入试纸探针（Nfo probe），可以用层析试纸条观察结果。

Question 8

Q8：RPA/RAA冻干版和液体版什么区别？如何选择？

Accepted Answer

冻干版：使用方便。总反应体积是固定的，20ul。
液体版：使用灵活。例如可调整反应体积，比如10ul，20ul或50ul。

Question 9

Q9: 试纸条型与荧光型的区别是？如何选择？

Accepted Answer

试纸条和荧光型的，只是底物不同。
试纸条通量小，只有一个阴阳结果，成本高。不利于结果分析，条件优化。
荧光型的通量高，可以在荧光仪上定量分析，建议研发阶段用荧光型的，优化好条件后，直接更换试纸条型的底物即可。

Question 10

Q10：阳性对照组无信号，怎么办？

Accepted Answer

PCR仪、qPCR仪需确保关闭热盖，可以提前选择关闭热盖选项后运行程序使得热盖开始降温，具体如何控制热盖温度请根据型号咨询厂家。一般PCR仪、qPCR仪打开电源后热盖会马上升温直到105℃。虽然选择了关闭热盖，但是热盖温度已经是105℃，因此需要确保热盖温度降到合适的温度，例如在50℃以下才可以把反应管放进去反应，否则热盖温度传导到底部，会把酶部分失活或全部失活。

Question 11

Q11：为什么扩增进入平台期后，荧光信号会下降？

Accepted Answer

偶尔会出现荧光值下降的情况。特别是对于长时间反应，共价键断裂或荧光团与周围分子之间的非特异性反应，出现光漂白现象。

Question 12

Q12：在侧流层析上检测恒温扩增产物需要稀释扩增产物吗？

Accepted Answer

需要，因为恒温扩增反应中的拥挤剂和蛋白质会干扰侧向流动条上的抗体，因此如果您没有充分稀释它们，您可能会得到非特异性结合的假阳性信号。

Question 13

Q13： 阳性对照有信号，实验组无信号，怎么办？

Accepted Answer

1、试剂组分请充分混匀，加完样后需确保混匀（上下倒置甩或弹数次混匀，瞬时离心，重复3次。）
2、请最后再加Starter，把Starter加到管盖或管壁上（不要直接加到模板或试剂中），最后再一起混匀。
3、引物不合适。重新检查引物。
4、模板降解或浓度过低。高浓度模板，梯度稀释，评估引物。例如从10^8 copies/ml 稀释至10^1 copies/ml。

Question 14

Q14：RPA(RAA) 恒温扩增为什么阴性对照组或无模板对照组有信号？

Accepted Answer

1.最常见的是交叉污染或气溶胶污染。尤其是第一次实验，阴性对照组没有信号，后来阴性对照有信号。或者阴性对照的信号非常强。这种情况建议用全新的试剂，换个环境做。加样顺序：先加阴性对照，然后样本，最后阳性对照。
2.如果第一次实验，阴性对照组就有信号，一般是引物/探针的特异性不佳，导致的非特异扩增。建议重新设计优化引物和探针。
3.探针浓度过高，引起非特异性切割，造成背景信号升高。（这种情况，信号一般是缓慢增加。）
收到后，建议分装保存。例如分成3～5管，避免反复使用同一管，造成交叉污染。

Question 15

Q15：RPA(RAA)基础型产物怎么看结果？是否需要纯化？

Accepted Answer

可以通过跑DNA琼脂糖胶来看扩增产物。
跑胶前，建议65°C加热10分钟终止反应。可选步骤：纯化产物后再跑胶，这样条带会更干净。产物纯化可以用柱膜法，磁珠法或者乙醇沉淀法等。具体操作步骤，请参考纯化试剂盒说明书。 （RPA恒温扩增荧光型不能通过跑胶看结果，因为里面的核酸外切酶会把产物降解。）

Question 16

Q16：为什么进入平台期后，荧光曲线会飙升？

Accepted Answer

反应中的聚合酶和核酸外切酶 III（Exo） 正在竞争。当反应耗尽能量时，核酸外切酶 III（Exo） 开始占据主导地位。这会导致更快的切割探针，所以荧光曲线会突然飙升。

Question 17

Q17： RPA和RAA有什么不同？

Accepted Answer

RPA (重组酶聚合酶扩增，Recombinase Polymerase Amplification)与 RAA (重组酶辅助扩增，Recombinase Aided Amplification) 本质为同一技术，只是名称表述不同 ，均指重组酶等温扩增技术。

Question 18

Q18：实验组有批间差异怎么办？

Accepted Answer

1、试剂组分请充分混匀，加完样后需确保混匀（上下倒置甩或弹数次混匀，瞬时离心，重复3次。）
2、请最后再加Starter，把Starter加到管盖或管壁上（不要直接加到模板或试剂中），最后再一起混匀。
3、其他组分（除Starter和Reaction buffer）混合后再加入到Reaction buffer均一性更稳定。
4、PCR仪、qPCR仪需确保关闭热盖，可以提前选择关闭热盖选项后运行程序使得热盖开始降温，具体如何控制热盖温度请根据型号咨询厂家。一般PCR仪、qPCR仪打开电源后热盖会马上升温直到105℃。虽然选择了关闭热盖，但是热盖温度已经是105℃，因此需要确保热盖温度降到合适的温度，例如在50℃以下才可以把反应管放进去反应，否则热盖温度传导到底部，会把酶部分失活或全部失活。

Question 19

Q19：关于RPA恒温扩增试剂盒，如何选择？

Accepted Answer

-基础型，类似PCR，只是完成DNA扩增，用DNA胶观察结果或与CRISPR技术结合使用。:
-荧光型，在基础型的基础上，引入荧光探针（Exo probe），类似荧光探针PCR。可以用荧光仪读荧光值。
-试纸型，在基础型的基础上，引入试纸探针（Nfo probe），可以用层析试纸条观察结果。
经验分享：
-荧光型试剂盒，可以读荧光数值，可以量化，可以同时做多个条件，适合探索优化实验条件，筛选引物和探针。
-试纸型试剂盒，和荧光型设计原理高度相似，在荧光型的引物探针基础上，比较容易得到好用的引物组和探针。

Question 20

Q20：RPA(RAA) 恒温扩增（荧光型）选择哪个荧光通道？

Accepted Answer

用FAM通道读取结果。（羧基荧光素）吸收波长492nm,发射波长518nm.

Question 21

Q21：RPA(RAA) 恒温扩增（荧光型和试纸型）探针与引物重叠怎么办？

Accepted Answer

探针THF位点前的大概27-30个bp的同向序列可以与引物重叠

Question 22

Q22：关于RPA 恒温扩增的灵敏度是多少？试剂盒中提供的阳性对照品的浓度是多少？

Accepted Answer

RPA/RAA，CRISPR DNA/RNA 检测试剂盒灵敏度一般最低能做到100copies/反应。
试剂盒中阳性对照参考品浓度大约10^5copies/ul

产品	RPA	LAMP	RCA	PCR
温度	37~42°C	60~65°C	30~42°C 或室温	95℃-55℃-72℃循环
特异性
灵敏度
仪器	简易装置	简易装置	不需要	精密仪器
反应时间	15~30分钟	20~40分钟	>4小时	90~120分钟
成本	高	低	低	低
应用	1、CRISPR 检测 2、荧光检测 3、侧向层析（试纸条）检测	1、CRISPR 检测 2、SNP 分型 3、荧光检测 4、侧向层析检测	1、信号放大 2、SNP 分析 3、测序应用	1、医学检验 2、法医鉴定 3、农林牧渔检测 4、中心实验室检测

RPA 恒温扩增试剂盒

产品概述

产品全面

规模化生产

持续迭代

稳定可靠

产品列表

RPA DNA 恒温扩增试剂盒 (基础型)

RPA DNA 恒温扩增试剂盒 (试纸型)

RPA DNA 恒温扩增试剂盒 (荧光型)

RT-RPA RNA 恒温扩增试剂盒 (基础型)

RT-RPA RNA 恒温扩增试剂盒 (试纸型)

RT-RPA RNA 恒温扩增试剂盒 (荧光型)

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