Primer & Probe Design for RPA

RPA Primer & Probe Design

Primer & Probe Design for RPA

在浏览器中完成目标序列输入、参数配置与候选点位筛选的全流程。无需安装本地客户端，省去环境部署，专注实验设计本身。

Input Sequence

推荐桌面端使用，手机端结果可阅读性差且没有History功能。

产品简介

RPA Primer & Probe Design 是一款面向 Recombinase Polymerase Amplification（RPA） 的在线设计工具，可自动完成 RPA 引物与探针（Probe） 设计，并生成适用于实验验证的候选方案。

基于 PrimedRPA 算法构建，无需安装本地软件或配置 Python 环境，即可在线完成参数设置、任务提交、结果分析与历史记录管理。

支持 单序列与多序列输入，结合保守性分析、GC 含量评估、二聚体风险分析及背景交叉反应筛选，帮助研究人员快速获得适用于病原检测、分子诊断及 POCT 开发的 RPA 引物与探针组合。

  • 自动设计引物与探针

    根据目标序列自动生成 RPA 引物及 Probe 候选方案。

  • 智能筛选与排序

    综合评估 GC 含量、重复碱基、二聚体风险及背景匹配风险。

  • 支持多种探针模式

    兼容 EXO 与 NFO 等常用 RPA 检测方案。

  • 多序列保守区分析

    支持多序列输入，自动识别保守区域并生成设计结果。

How to use?

STEP 1

输入目标序列（粘贴 FASTA 或上传文件）。

STEP 2

按实验需求设置Options / Advanced Setting / Background Check参数。

STEP 3

点击“开始设计”，系统将提交任务并自动计算。

STEP 4

任务完成后在新标签查看结果，并下载完整文件。

参数详情

Input

  • Input Sequence

    输入待设计目标序列（支持 FASTA）。若上传文件与文本同时存在，系统优先使用文本输入。

  • Upload FASTA File

    当目标序列较长或来自外部文件时使用，推荐上传标准 .fa/.fasta/.txt。

Options

  • Probe Required

    控制是否同时设计探针以及探针类型（NO/EXO/NFO），会影响最终推荐方案与结果结构。

  • Desired Primer Length

    限定引物长度范围或固定长度。长度过短影响特异性，过长可能降低扩增效率。

  • Desired Probe Length

    限定探针长度范围或固定长度，用于平衡结合稳定性与检测灵敏度。

  • Max Amplicon Length

    扩增产物最大长度限制。通常片段越短，扩增速度与检测稳定性越好。

  • Repeat Nucleotide Cut-off

    限制同一碱基连续重复上限，降低低复杂度区域导致的非特异风险。

  • GC Range (Min / Max)

    控制候选序列 GC 含量区间。过低影响结合稳定，过高可能增加二级结构。

  • Maximum Number of Sets

    控制输出候选组合的上限，用于平衡结果覆盖度与后续筛选成本。

Advanced Setting

  • Input FASTA Classification

    声明输入序列类型（单序列/多序列未比对/多序列已比对），影响内部解析与比对策略。

  • Primer/Probe Identity Threshold (%)

    同源性阈值；值越高，保守性要求越严格。用于多序列输入的一致性控制。

  • Dimerisation Threshold (%)

    控制引物二聚体风险阈值；阈值设置用于过滤潜在互补结合过强的候选。

  • Background Cross-reactivity Threshold (%)

    背景交叉反应阈值；用于筛除与背景序列匹配度过高的候选。仅在输入 Background 序列（文本或文件）后可修改。

  • Background Hard Fail Filter

    是否启用严格背景过滤。开启后会更激进地剔除高风险候选。仅在输入 Background 序列（文本或文件）后可修改。

  • Blastn Cross Reactivity Search Settings

    背景检索强度（Basic/Advanced/Fast），用于平衡计算速度与筛选精细度。仅在输入 Background 序列（文本或文件）后可修改。

  • Blastn Evalue

    背景比对显著性阈值。值越小越严格，通常用于控制背景命中容忍度。仅在输入 Background 序列（文本或文件）后可修改。

Background Check

  • Background Sequence

    可输入背景 DNA 序列用于排除离靶风险。若不填写，则跳过该部分严格筛选。

  • Upload Background FASTA

    背景序列较多时建议上传文件，便于完整做背景交叉反应评估。

参数调优建议

出不来结果时（优先放宽）

  • IdentityThreshold（例如 99 -> 95）
  • DimerisationThresh（适度上调）
  • CrossReactivityThresh（适度上调）
  • AmpliconSizeLimit（适度增大）

结果太多或计算慢时（优先收紧）

  • 缩小 PrimerLength / ProbeLength 区间
  • 降低 MaxSets
  • 背景敏感度使用 Fast

计算原理

STEP 1

输入与预处理

01服务接收目标序列（InputSequence 或 InputFile）。
02参数包括：引物/探针长度、GC 范围、同源性阈值、重复碱基限制、扩增子长度上限、二聚阈值、背景筛选阈值等。
03ProbeRequired 决定是否进入探针流程：NO 仅做 FP/RP；EXO/NFO 做 FP/RP + Probe。

STEP 2

构建保守性摘要（Alignment Summary）

01若输入是多序列（MS），先统一到同一比对坐标。
02对每个位点统计共识碱基（Most common nucleotide）与一致性分数（IdentityScore）。
03形成全长 alignment summary，后续候选从该“位点评分地图”滑窗产生。

STEP 3

候选寡核苷酸扫描（Primer/Probe 候选生成）

01按候选类型（Primer / Probe）与长度（单值或区间）遍历起始位点，逐窗生成候选序列。
02每个候选会记录：起始位点、长度、平均同源性、5'/3' 连续保守锚点长度、GC%、自二聚/结构评分。

STEP 4

候选过滤（单条序列级）

01同源性过滤：IdentityScore >= IdentityThreshold。
02GC 过滤：MinGC < GC < MaxGC；重复碱基过滤：不允许超过 NucleotideRepeatLimit。
03自互补/二级结构过滤：评分不能超过 DimerisationThresh。
04探针特异过滤：EXO 会执行特定 motif/位点规则。
05背景交叉反应过滤（可选）：against 背景库 BLAST + 高级交叉反应分数，超过 CrossReactivityThresh 淘汰；HardCrossReactFilter!=NO 时 hard-fail primer 直接淘汰。

STEP 5

组合搜索（FP/RP/Probe）

01在通过单条过滤的候选中组装组合（FP/RP/Probe）。
02组合约束：扩增子长度不超过 AmpliconSizeLimit；有 probe 时需满足探针插入逻辑；组合内部两两互作评分超过阈值则淘汰。
03通过后记录 FP/RP/Probe 序列与位点、Amplicon Size、组合最大二聚评分、背景最大交叉反应评分（若启用背景）。

STEP 6

结果排序与裁剪

01按 Max Dimerisation Percentage Score 升序排序（越小越优）。
02最终输出结果表格与下载包（含对齐摘要、候选位点、最终组合）。

开源项目引用说明

项目：PrimedRPA: RPA Primer and Probe Set Finder - Higgins M et al. Submitted. 2018 - GPL-3.0

项目地址：https://github.com/MatthewHiggins2017/bioconda-PrimedRPA

合规说明（当前部署）：当前部署为服务端调用 PrimedRPA 执行计算并通过接口返回结果，未向终端用户分发 PrimedRPA 程序副本；在该场景下不触发 GPL 的分发源码义务。

FAQ

Q1：结果显示: Input sequence can not be empty.

原因：既没传 InputSequence，也没传 InputFile。处理：二选一必填。

Q2：输入序列支持哪些规模？

支持多序列输入(Input fasta classification需选择MS或MAS)，最多10条序列；每条序列最多1000个碱基。超出序列数会被自动舍弃。碱基数超出，会报错。

Q3：结果显示: Input file must be UTF-8 text.

原因：上传文件编码不是 UTF-8。处理：转为 UTF-8 再上传。

Q4：结果显示: Sequence contains invalid characters. Only A/C/T/G/U are allowed.

原因：序列含非 ACTGU 字符（如数字、符号、扩展字母）。处理：清理非法字符后重试。

Q5：结果显示: Sequence length must be less than 1000.

原因：序列长度超过后端限制。每段序列最多1000个碱基。

Q6：结果显示: Alignment file error length of all sequences is not equal

原因：多序列输入（MS）各条序列长度不一致。处理：先做标准 MSA，确保长度一致后再提交。

Q7：结果显示: No Oligos Passed Filtering

原因：候选在单条过滤阶段全部被淘汰。常见触发：IdentityThreshold 太高、GC 区间太窄、NucleotideRepeatLimit 太严格、DimerisationThresh 太严格、背景筛选阈值太严格。处理：逐步放宽约束（优先 Identity、GC、Dimer、CrossReactivity）。

Q8：结果显示: No valid primer-probe combinations found

原因：单条候选存在，但组合阶段全失败。常见触发：AmpliconSizeLimit 太小、Probe 必选导致组合空间不足、组合互作评分超阈值。处理：适度增大 AmpliconSizeLimit，或放宽 dimer/长度范围。

Q9：结果显示: PrimedRPA timed out after N seconds

原因：任务在超时时间内未完成（序列长、参数宽、背景库大时更明显）。处理：缩小搜索空间（MaxSets、长度区间、背景敏感度），或提升超时上限。

Q10：结果显示: RPA processing failed

原因：运行时未分类异常（依赖工具异常、资源不足、临时文件问题等）。处理：携带 task_id / request_id 反馈后端排查日志。

Q11：结果显示: 排队中（QUEUED）是什么意思？

服务器资源有限，同时运行任务数量过多时，新增任务要等待已有任务计算完成，才开始计算。

Q12：单序列与多序列模式有什么区别？

单序列模式（SS）直接使用输入序列进行设计；多序列模式（MS）会先在统一坐标下对齐，再基于保守位点生成候选。若是多序列输入，请先确保序列质量和格式一致。

Q13：为什么建议提供背景序列（Background Check）？

背景筛选可以显著降低与近缘非目标序列的交叉反应风险。特别是高同源场景（如同属病原）建议开启背景检查并合理设置 CrossReactivity 阈值。

Q14：为什么有些背景相关参数会被禁用？

当未输入背景内容（背景文本或背景文件）时，背景筛选相关参数会自动禁用并使用系统默认占位值；只有提供了背景内容后，这些参数才会变为可编辑。

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