STEP 1
粘贴目标 DNA 序列或实际扩增产物。支持纯序列与单条 FASTA，只识别 A/T/C/G，长度需在 36–1000 nt 之间。
Argonaute 核酸检测设计
gDNA Designer
面向 PfAgo、TtAgo 等 Argonaute 核酸检测的引导链在线设计。粘贴一段目标序列，一次拿到整套引导链：gDNA1、gDNA2、gDNA3 与 Reporter DNA；切点关系、评分与示意图同屏核对，看完即可下单合成。当前按 PfAgo 规则计算。
gDNA Designer 是什么
gDNA Designer 是易致生物推出的免费在线 Argonaute 引导链设计工具，面向 PfAgo、TtAgo 一类以 DNA 为引导链的核酸检测体系。粘贴一段目标 DNA 或扩增产物，一次提交就能拿到一整套可直接合成的检测序列：gDNA1、gDNA2、gDNA3 与 Reporter DNA。当前按 PfAgo 规则计算。
PfAgo 这类 Argonaute 检测靠的不是一条引导链，而是一套级联：gDNA1 和 gDNA2 在同一条链上切出两个切点，中间那段就是 gDNA4；gDNA3 在另一条链上、gDNA4 区间内切割；Reporter DNA 则是 gDNA4 的反向互补，负责产出可读信号。四条序列靠切点坐标彼此约束，动一条就得跟着改其余几条。
手工设计这套关系很容易顾此失彼：每条引导链都要同时满足长度、GC、同聚物、回文等约束，三个切点的相对位置又不能错。gDNA Designer 把这些规则固化进引擎，一次提交返回整套方案，并按整套级联的综合评分排序，不合格的候选根本进不了结果。
每套方案都附带结合区间、结合链和切点位置，示意图把双链、杂交位置与三个切点画在一起；结果可整套复制、可导出 CSV，gDNA 自动带上 5′-P- 磷酸化标记。下单合成之前先在页面上核对一遍，再决定用哪一套。
整套输出
一次返回 gDNA1 / gDNA2 / gDNA3 / Reporter DNA 四条序列，不用自己拼装。
切点看得见
示意图画出双链、杂交位置和三个切点，每条序列都附结合区间与结合链，逐一可对照。
规则内置
PfAgo 的长度偏好、GC、同聚物、回文、首尾互补、引物避让等硬约束由引擎统一把关。
按整套排序
给整套级联打分排序，而不是单条引导链；从排名靠前的方案开始验证。
如何使用
STEP 2
确认酶种。Argonaute 家族里 PfAgo、TtAgo 都以 DNA 作引导链，但当前引擎只实现了 PfAgo 的规则，页面固定按 PfAgo 计算，无需选择；TtAgo 暂不支持。
STEP 3
如果已经有扩增引物，把正向/反向引物一并填入。引物不参与设计：与引物区域重叠的候选直接淘汰，与引物存在局部互补风险的候选会扣分。
STEP 4
设置返回方案数（1–30，本页默认 20），提交后在结果页逐个查看方案，并用示意图核对切点关系。
参数与规则说明
输入参数
目标序列
必填。目标 DNA 或实际扩增产物，只接受 A/T/C/G，长度 36–1000 nt。支持纯序列或单条 FASTA（标题行会被忽略）。
酶种
Argonaute 预设。当前只支持 PfAgo（PFAGO），页面已固定提交该值；TtAgo 等其余取值会被服务端拒绝。
正向 / 反向引物
选填，本身不是设计对象。引擎会在两条链上找出引物及其反向互补出现的位置：与这些区域重叠的候选直接淘汰；引导链中任意 ≥8 nt 片段与引物局部匹配的，单条评分扣 8 分。
返回方案数
范围 1–30，本页默认取 20。最终按整套级联的总分从高到低返回。
筛选规则
长度
16 → 17 → 18 → 15 nt 分层尝试，先用 16 nt，方案不够再放开。
GC 含量
40%–80%，超出直接淘汰。
同聚物
不允许 GGGG，也不允许 A / C / T 连续 5 个及以上。
回文与首尾互补
整条自身反向互补的淘汰；首尾 5 nt 反向互补的淘汰，完全无解时才放宽。
适用范围
以上规则对 gDNA1–4 四条一律生效，gDNA4 不合成也要过。
级联关系
gDNA1 / gDNA2
在同一条链上分别切在 gDNA4 区间的起点和终点，两个切点之间释放出的片段就是 gDNA4。
gDNA3
来自另一条链，切点必须落在 gDNA4 对应到该链上的 5′ 端第 1 或第 2 位；与 gDNA1 在对侧完全对应的组合会被排除。
切点位置
切点固定在配对窗口终点向前 10 nt 的边界上，对应引导链 5′ 端起第 10 与第 11 位之间——这是 Argonaute 的典型切割位置。
Reporter DNA
gDNA4 的反向互补，用于产生可读出的信号。
坐标口径
接口返回 0-based 半开区间，页面上统一换算成 1-based 闭区间展示，并把互补链编号的坐标折算回参考链。
评分规则
六个维度
每条序列按结合自由能 ΔG（35%）、二级结构 MFE（30%）、GC（15%）、同聚物（10%）、末端碱基（5%）、Tm（5%）加权，得 0–100 的单条总分。
热力学条件
ΔG、Tm 按最近邻模型在 37 ℃、150 mM Na⁺、200 nM 链浓度下估算；MFE 优先用 ViennaRNA，不可用时退回本地近似模型。
末端与同聚物
首位碱基为 A/T 得满分，为 C/G 得 40 分；最长同聚物 ≤2 得满分，=3 得 70 分。
方案总分
gDNA1、gDNA2、gDNA3、gDNA4 四条单条总分的平均值。同分时警告少的方案排前面。
多样性抽样
不是简单取前 N 高分：先取高分候选池，按切点骨架分组做多样性抽样，再按总分排序返回，避免一屏全是只差一位的近似方案。
输入参数
目标序列
必填。目标 DNA 或实际扩增产物，只接受 A/T/C/G，长度 36–1000 nt。支持纯序列或单条 FASTA（标题行会被忽略）。
酶种
Argonaute 预设。当前只支持 PfAgo（PFAGO），页面已固定提交该值；TtAgo 等其余取值会被服务端拒绝。
正向 / 反向引物
选填，本身不是设计对象。引擎会在两条链上找出引物及其反向互补出现的位置：与这些区域重叠的候选直接淘汰；引导链中任意 ≥8 nt 片段与引物局部匹配的，单条评分扣 8 分。
返回方案数
范围 1–30，本页默认取 20。最终按整套级联的总分从高到低返回。
评分规则
六个维度
每条序列按结合自由能 ΔG（35%）、二级结构 MFE（30%）、GC（15%）、同聚物（10%）、末端碱基（5%）、Tm（5%）加权，得 0–100 的单条总分。
热力学条件
ΔG、Tm 按最近邻模型在 37 ℃、150 mM Na⁺、200 nM 链浓度下估算；MFE 优先用 ViennaRNA，不可用时退回本地近似模型。
末端与同聚物
首位碱基为 A/T 得满分，为 C/G 得 40 分；最长同聚物 ≤2 得满分，=3 得 70 分。
方案总分
gDNA1、gDNA2、gDNA3、gDNA4 四条单条总分的平均值。同分时警告少的方案排前面。
多样性抽样
不是简单取前 N 高分：先取高分候选池，按切点骨架分组做多样性抽样，再按总分排序返回，避免一屏全是只差一位的近似方案。
筛选规则
长度
16 → 17 → 18 → 15 nt 分层尝试，先用 16 nt，方案不够再放开。
GC 含量
40%–80%，超出直接淘汰。
同聚物
不允许 GGGG，也不允许 A / C / T 连续 5 个及以上。
回文与首尾互补
整条自身反向互补的淘汰；首尾 5 nt 反向互补的淘汰，完全无解时才放宽。
适用范围
以上规则对 gDNA1–4 四条一律生效，gDNA4 不合成也要过。
级联关系
gDNA1 / gDNA2
在同一条链上分别切在 gDNA4 区间的起点和终点，两个切点之间释放出的片段就是 gDNA4。
gDNA3
来自另一条链，切点必须落在 gDNA4 对应到该链上的 5′ 端第 1 或第 2 位；与 gDNA1 在对侧完全对应的组合会被排除。
切点位置
切点固定在配对窗口终点向前 10 nt 的边界上，对应引导链 5′ 端起第 10 与第 11 位之间——这是 Argonaute 的典型切割位置。
Reporter DNA
gDNA4 的反向互补，用于产生可读出的信号。
坐标口径
接口返回 0-based 半开区间，页面上统一换算成 1-based 闭区间展示，并把互补链编号的坐标折算回参考链。
设计原理
STEP 1
归一化输入
01去掉 FASTA 标题行与全部空白字符，统一转成大写。
02校验字符集与长度：只允许 A/T/C/G，长度需落在 36–1000 nt。
03如果提供了引物，标记出引物覆盖的区域，后续候选会避开这些位置。
STEP 2
建立候选池
01按 PfAgo 预设在参考链和互补链上同时滑窗，先只取 16 nt 候选，方案数不够再依次放开 17、18、15 nt。
02对每条候选做硬性过滤：GC 区间、连续 GGGG、A/C/T 长同聚物、整条回文、首尾 5 nt 互补、引物区域重叠。
03记录每条候选的结合区间、结合链与切点位置（配对窗口终点向前 10 nt），并按切点建索引——后面组装级联全靠它。
STEP 3
组装级联
01在每条链上枚举 gDNA4 区间（16–18 nt，兜底 15），gDNA4 自己也要过同一套过滤和评分。
02在同一条链的候选里找切点正好落在 gDNA4 起点和终点的引导链，各取评分最高的 3 条，作为 gDNA1 与 gDNA2。
03再到对面那条链上找切点落在 gDNA4 5′ 端第 1 或第 2 位的引导链作为 gDNA3，同样取前 3 条；每个 gDNA4 最多组出 5 套方案。
STEP 4
评分与排序
01Reporter 取 gDNA4 的反向互补，至此四条交付序列全部确定。
02每条序列按 ΔG、MFE、GC、同聚物、末端、Tm 六个维度加权打分，方案总分是 gDNA1–4 四条单条总分的平均值。
03不直接取前 N 高分：先取高分候选池，按切点骨架分组做多样性抽样，最后按总分从高到低返回，同分时警告少的排前。
常见问题
PfAgo 是什么？
PfAgo（Pyrococcus furiosus Argonaute）是一种来自嗜热古菌的 Argonaute 蛋白。它以短链 DNA 作为引导链（guide DNA），按碱基互补在目标 DNA 上找到位点并切割，常用于恒温条件下的核酸检测体系。本工具当前只支持 PfAgo。
TtAgo 是什么？和 PfAgo 有什么区别？
TtAgo（Thermus thermophilus Argonaute）是来自嗜热栖热菌的 Argonaute 蛋白，同样以 5′ 磷酸化的短链 DNA 作为引导链切割目标 DNA，但来源、工作温度和对引导链的偏好与 PfAgo 不同，设计规则不能直接套用。本工具目前只实现了 PfAgo 的规则，暂不支持 TtAgo。
gDNA（引导链）是什么？
gDNA 即 guide DNA，是被 Argonaute 蛋白加载的短链 DNA，通过碱基互补与目标链杂交，并决定切割位点。本工具输出的 gDNA1、gDNA2、gDNA3 都是需要合成的引导链，长度通常为 15–18 nt，合成时 5′ 端需要磷酸化修饰。
为什么需要三条引导链？
PfAgo 检测依赖一段被精确切下的目标片段。gDNA1 与 gDNA2 负责在同一条链上切出两个切点，界定出 gDNA4；gDNA3 则在另一条链上、gDNA4 区间内切割。三者缺一，级联就无法完成。
gDNA4 需要合成吗？
不需要。gDNA4 是被切割释放出来的目标片段，不是交付序列。它的作用是解释 Reporter 的来源——Reporter 就是 gDNA4 的反向互补。真正需要合成的是 gDNA1、gDNA2、gDNA3 和 Reporter DNA。
Reporter DNA 是什么？
Reporter DNA（报告链）是 gDNA4 的反向互补序列，在检测体系中负责产生可读出的信号。它需要合成，但不做 5′ 磷酸化修饰。它的序列由 gDNA1、gDNA2 的切点位置决定，所以引导链一变，Reporter 也跟着变。
「切点」和「级联」分别指什么？
切点（cut position）是 Argonaute 在目标链上的切割位置，页面按 1-based 闭区间展示。级联（cascade）是三条引导链靠切点关系相互约束构成的一整套设计——结果页里的每个「方案」就是一套级联，评分和排序按整套方案计算，而不是单条引导链。
目标序列该放扩增产物还是原始基因序列？
建议直接放实际扩增产物。设计结果的坐标是相对于你输入的这条序列的，用扩增产物可以保证引导链落在真实存在的区域内，也便于配合引物避让功能。
填引物有什么用？
引物本身不参与设计。填入后引擎会在两条链上找出引物及其反向互补出现的位置：与这些区域重叠的候选直接淘汰；引导链中有 ≥8 nt 片段与引物局部匹配的，单条评分扣 8 分。这样能减少引导链和引物在反应体系里互相干扰。
为什么有时候一条方案都出不来？
通常是目标区域太短或碱基组成太极端。GC 必须落在 40%–80%，不能出现 GGGG 或 A/C/T 的长同聚物，整条引导链不能自身回文，还要在两条链上同时凑齐切点位置正确的三条引导链。可以换一段目标区域、适当扩大输入范围，或检查引物是否盖住了大半序列。
同一条序列，为什么两次结果不完全一样？
返回的方案不是简单取前 N 高分，而是从高分候选池里按切点骨架分组做多样性抽样，再按总分排序。抽样的随机种子默认由输入参数和当天日期生成，所以同一天同一输入结果稳定，隔天再跑可能换一批相近的方案。要复现某次结果，保留那次的任务链接即可。
结果里的坐标怎么读？
接口返回的是 0-based 半开区间，页面上已统一换算成 1-based 闭区间显示。gDNA3 一类按互补链编号给出的坐标，也已经折算回参考链坐标系，所以四条序列的区间可以直接横向比较。
相关工具
同一套检测方案里，引物设计在 Argonaute（PfAgo / TtAgo）检测的上游；CRISPR crRNA 是另一条技术路线，可以对照选择。
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